Archive

Bactérie

Mesure rapide de la Listeria Monocytogenes sur les surfaces

Séverine Blanc et Dominique Cerqueira, 40-30 | 30 juillet 2014 |

La Listeria monocytogenes est comptée parmi le top 10 des bactéries à proscrire dans des produits destinés à la consommation humaine. Comment la mesurer ?

 

 

                        Biofilm de L. monocytogenes observé par EDIC.

 

La validation de l’absence de bactéries sur les surfaces est un axe prioritaire dans les industries pharmaceutiques, cosmétiques, médicales et agroalimentaires. De nouvelles méthodes de désinfection existent (Lire le Dossier sur la désinfection des surfaces par voie aérienne du n° 89 de la revue Salles Propres), mais quid de la mesure pour vérifier que les bactéries n’ont pas survécu ? Les mesures traditionnelles demandent du personnel qualifié dans un laboratoire souvent externe et un délai pour obtenir les résultats proche de 48 heures… Insuffisant pour des bactéries comme la Listeria monocytogenes qui fait partie du top 10 des bactéries à proscrire dans des produits destinés à la consommation humaine.

 

Contexte


Le genre Listeria compte six espèces (L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii et  L. grayi) parmi elles, L. monocytogenes est la principale bactérie pathogène pour les mammifères. Elle se retrouve dans les sols, les eaux et les animaux tels que les oiseaux, les insectes et les mammifères. Ce micro-organisme a la capacité de se développer sous forme de biofilm qui est plus adhérent qu’une cellule sur une surface et qui prolifère très vite. Lors de la formation d’un biofilm, il se forme une matrice qui est plus résistante aux solutions stérilisantes qu’une simple cellule.
La listériose, maladie issue de cette bactérie est potentiellement mortelle pour les populations à risque (nouveau-nés, femmes enceintes et personnes immuno-déficientes). En 2011, il a été recensé en France, 282 cas dont 49 décès et 9 morts fœtales ou de mort-nés. C’est une maladie rare qui représente moins de 0,5 cas/100 000 habitants, mais elle a un impact sur la santé publique du fait de sa létalité élevée et de sa transmission alimentaire [1]. Pouvant se développer sur une longue plage de température i.e. à partir de -2 et jusqu’à 45 °C dans des solutions pH de 4,6 à 9,6, la L. monocytogenes est une bactérie très résistante. Elle doit donc faire l’objet d’attention particulière lors de la fabrication et/ou la transformation d’aliments [2]. La contamination croisée, les insectes, les fluides, les équipements peuvent être des sources de la dispersion de la Listeria [3]. Soixante-dix crises sanitaires importantes sont référencées dont sept crises importantes en France depuis 1992 [4]. Ainsi le contrôle de l’absence de bactéries viables ou non viables est indispensable sur les aliments et les surfaces des équipements utilisés dans les procédés.
La recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments et les surfaces sont régis par les normes ISO11290-1 et ISO 11290-2. Ces normes prévoient cinq phases. Sur les surfaces inertes, ces phases peuvent être décrites selon les lignes qui suivent. La première phase consiste à échantillonner en essuyant la surface avec un stick ou à tamponner la surface à l’aide d’une plaque contenant un gel. L’étape 2 est la mise en solution du prélèvement. La phase suivante est le dépôt de la solution dans une boite de culture sur sang de mouton ou autre milieu de culture riche. La phase 4 est une étape d’attente entre 12 et 48 heures pour permettre aux bactéries de se développer. Enfin, les colonies sont comptabilisées par observation en CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie).

 

Tableau 1 Quelles unités utiliser ?


Unité

Application

Remarque

CFU/g

Pour les aliments solides

Dans la norme : ne pas dépasser 100 CFU/g

CFU/mL

Pour les aliments liquides

Pour les fluides de procédé (eau…)

Généralement 1 mL équivaut à 1 g

CFU/cm²

Pour les surfaces d’environnement (mur, sol, pièce d’équipements…)

Pas de spécification dans les rapports [2]


 Néanmoins, cette méthode traditionnelle [6] présente des limites importantes avec un faible taux de récupération du microorganisme avec les méthodes de prélèvement manuel, une faible sensibilité de la technique de détection (pas de cellules mortes observées), d’un besoin de matériel spécifique et de personnels spécialement formés et enfin, une durée longue (résultats disponible en 2 à 5 jours si une confirmation est nécessaire).
Compte tenu de ces limitations, d’autres méthodes de mesure de la Listeria sur les surfaces ont été développées depuis une vingtaine d’années [5]. Ces méthodes peuvent être soit pour du dépistage soit pour de la confirmation de la présence d’une ou plusieurs espèces de Listeria. Le niveau d’identification varie d’une méthode à une autre, certaines sont spécifiques à la seule L. monocytogenes.
La bio-impédance mesure la tension créée par le passage d'un très faible courant dans les tissus biologiques. Cette mesure nécessite des courbes d’étalonnage avec des quantités de bactéries élevées. De récentes études [7] montrent qu’en présence de bio-capteurs, les bactéries sont identifiées plus rapidement et de manière plus sensibles que la méthode traditionnelle.
La méthode ELISA pour Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, détecte la présence d’antigènes ou d’anticorps suite à une réaction avec une enzyme. Le produit de la réaction est ensuite dosé par colorimétrie ou par fluorescence. Dans le cas de la L. monocytogenes, l’antigène est lié à un anticorps monoclonal spécifique. Par exemple l’équipement VidasTM LMO de Biomérieux permet ces mesures.
Une autre technique très développée repose sur la cytométrie en flux (CMF) avec l’existence d’équipements de plus en plus performants. Les micro-organismes sont marqués à l'aide de molécules fluorescentes, puis les bactéries sont analysées en continu, une à une, dans un flux de liquide au niveau de la chambre d’analyse. A l’aide d’un laser, les traceurs fluorescents sont excités et la lumière spécifique émise est détectée par des capteurs situés autour de la chambre d’analyse. La société METIS Biotechnologies à Limoges propose des kits de détection spécifiques de la Listeria (Listeria spp. et L. monocytogenes) et pour d’autres microorganismes.
La PCR pour Polymerase Chain Reaction permet de dupliquer en grand nombre une séquence d’ADN ou d’ARN connue, à partir d’une faible quantité d’acide nucléique. L’ADN de la bactérie est donc multiplié rapidement – en moins de 3 heures – et est ensuite identifiée par électrophorèse ou par séquençage automatisé.
Les tests 3M Petrifilm ListeriaTM sont des patchs qui reçoivent l’échantillon (sticks ou éponge) qui a précédemment été immergé dans une solution peptonée tamponée qui est un milieu de culture. En 30 heures, le résultat est visible par n’importe quel utilisateur et spécifiquement à la L. monocytogenes.
Une enquête menée auprès d’une dizaine d’industriels de l’agroalimentaire espagnol en 2010 montrait l’intérêt d’une mesure surfacique de la Listéria :
-    plus rapide (idéalement < 2 heures) ;
-    avec des résultats qui suffisent pour donner la présence ou absence ;
-    avec un appareil mobile et réalisable par un technicien sans compétence spécifique en analyses.
Le tableau 2 compare les techniques actuelles de mesure de la Listéria sur les surfaces.

 

Tableau 2 : Comparatif des mesures de Listeria sur les surfaces

 

 

Comptage mini

Durée

Équipement mobile

Nécessité d’un technicien formé

Coût d’une analyse

Méthode traditionnelle

100 CFU/g

12 à 72h

Non

Oui

Bio-impédance

qualitatif

<6h

Non

Oui

€€

ELISA

 

50h

Non

Oui

€€

CMF

 

24h

Non

Oui

€€

PCR

10 CFU/g

48h

Non

Oui

€€€

Tests 3M PetrifilmTM

qualitatif

30h

Oui

Non

Souhait des usagés

100 CFU/g

2h

Oui

Non

 

Description de la méthode développée


 

La méthode développée lors des projets européens « Biolisme », souhaite répondre aux souhaits des usagers en couplant entre autre les technologies ELISA et CMF. Elle est le cumul de trois technologies : technique de décontamination ultrapropre issue du secteur microélectronique, la microbiologie et de l’optique de pointe. Le système fonctionne en trois phases, échantillonnage, réaction et détection qui sont détaillées ci-dessous. La figure 1 schématise le nettoyage de la surface échantillonnée puis la fonctionnalisation des bactéries de L. monocytogenes présentes en solution et enfin la mesure de la présence de la bactérie par détection sous système optique :

 

Figure 1 : Les trois phases de la méthode « Biolisme »


L’échantillonnage


 

Le but de l’échantillonnage est de récupérer les bactéries d’une surface plane et de les introduire dans une solution d’eau. La principale contrainte est de récupérer la Listeria sans contaminer l’air ou les surfaces environnantes, il faut donc que l’échantillonnage soit réalisé de manière isolée. Ainsi un système de cloche sous vide (figure 2) permet la tenue de la sonde de récupération. Un mélange d’air comprimé et d’eau est envoyé sous pression dans la cloche qui permet un décrochage efficace des cellules et des biofilms de Listeria.

Les expériences menées ont d’abord porté sur la manière homogène et reproductible de déposer les bactéries [8], puis de mesurer l’efficacité du décrochage [9]. Le retrait de contamination d’une surface a d’abord été testé avec des particules d’alumine déposées en solution sur une surface de verre puis séchées. Le retrait approchait 50% d’efficacité. Néanmoins, après mesures des forces d’adhésion par RFC (Radial Flow Cell), il s’est avéré qu’une bactérie ou même un biofilm sur de l’acier inoxydable est moins adhérent que des particules d’alumine sur du verre. Les forces en présence sont d’environ 144 N/m² dans le cas de la Listéria alors que la force d’adhésion est de plus de 300 N/m² dans le cas de l’alumine [10]. La suite des tests avec des bactéries a confirmé des taux de retrait de plus de 90 %.

 

 

La réaction


 

Une fois la contamination retirée de la surface, il est nécessaire de concentrer la solution récupérée à la seule L. monocytogenes afin d’être détectée rapidement et avec certitude. La technique consiste à fonctionnaliser spécifiquement la bactérie de L.monocytogenes pour réduire le volume de solution et la rendre visible à la détection. La réduction de volume de solution est réalisée par l’ajout de particules métalliques. La visualisation est réalisée par l’ajout de particules fluorescentes.

Mais ces particules n’adhèrent pas naturellement à la Listéria. Pour pallier à cette non-adhérence, un anticorps monoclonal (mAb2B3) spécifique pour la protéine internaline A (InlA) - présente à la surface des cellules de L. monocytogenes - a été isolé. Il peut détecter L. monocytogenes à un niveau d'environ 100 CFU/mL et peut se lier spécifiquement à L. monocytogenes sérotypes 1a, 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 4a et 4b, mais pas aux autres espèces de Listéria. La fixation de cet anticorps sur L. monocytogenes dans la formation du biofilm a été étudiée en utilisant la microscopie par fluorescence [11].

Le choix des particules métalliques s’est porté sur des particules de fer. Ces particules doivent être plus petites que les bactéries afin d’éviter un encombrement de bactéries par particule. Elles doivent également être calibrées pour obtenir un empilement de taille uniforme. L’anticorps  mAb2B3 est donc préalablement fixé à des nanoparticules de fer ou à des particules fluorescentes carbonées.

Lorsque la bactérie en solution (l’échantillon) entre en contact avec l’anticorps lié aux nanoparticules de fer, un complexe ferromagnétique est créé. Cette structure est figée sous champ magnétique ce qui permet de nettoyer la solution et de ne laisser que les bactéries dans l’eau. Enfin, les bactéries sont liées au complexe anticorps avec particules fluorescentes qui sert à la détection (figure 3).

 

Figure 3 : Schéma détaillé de la réactivité, fonctionnalisation de la bactérie


La détection


 

La solution de bactéries fonctionnalisées avec des particules fluorescentes est acheminée vers la chambre de détection. Comme pour la CMF, le principe est d’exciter les particules fluorescentes et de les détecter par un système optique. Les études ont été menées sur l’émission de lumière optimum pour exciter les particules fluorescentes. Le laser dans l’UV est la source lumineuse la plus fiable. Le système est inclut dans une enceinte opaque pour éviter des bruits de fond trop importants liés à la pollution lumineuse environnementale.
Une camera CCD pour Charge-Coupled Device, permet une visualisation d’amas fluorescents présents dans un échantillon. Le résultat est qualitatif.
Un photomultiplicateur même s’il donne une information globale, permet de mesurer l’intensité lumineuse avec une meilleure sensibilité qu’une camera CCD. Le résultat est quantitatif avec une courbe d’étalonnage. La détection par photomultiplicateur donne une quantité de cellules/ mL qui est déduit de la quantité d’eau collectée lors du retrait des contaminations de surface dans la phase d’échantillonnage.
Le choix définitif de détection par caméra CCD ou par photomultiplicateur n’est pas encore fixé.


 

La première phase critique a été la création de surfaces en acier inoxydable et en TéflonTM avec une contamination Listéria homogène et reproductible. Pour obtenir de telles surfaces, les protocoles de nettoyage des surfaces, d’inoculation dans des solutions spécifiques à différentes températures et à différentes durées ont été rigoureusement développées.

La phase d’échantillonnage a fait l’objet de nombreux tests afin de définir le débit d’eau, la pression d’air comprimé et la durée de contact entre la surface et la sonde de mesure.
L’ajout de particules fluorescentes (Syto 9+TM) aux bactéries de Listeria, l’excitation sous laser et le comptage sous microscope permet de mesurer la quantité de Listéria collectée par la sonde Biolisme.
Les mesures suivant l’âge du biofilm, donnent des taux de récupération toujours un peu meilleurs que par rapport à une technique conventionnelle avec un racloir à cellules (tableau 3).

 

Tableau 3 : Comparaison des résultats

Age du biolfilm

Technique conventionnelle

Technique développée

4h

5.4

5.8

24h

6.2

6.5

48h

6.9

7.1

7 jours

7.2

7.4

Listéria collectée en log de cellules/ CFU/cm² sur une surface entre une technique conventionnelle et la technique développée.


La phase de réaction a demandé une étude poussée pour trouver l’anticorps le plus adapté à la L. monocytogenes et il a fallu fonctionnaliser cet anticorps aux autres réactifs.
Les particules métalliques doivent être d’une taille suffisamment petite pour éviter que les bactéries de Listéria ne s’accrochent en grand nombre sur une seule particule. Il a fallu également que ces particules soient hydrophiles et qu’elles ne s’oxydent pas facilement lorsqu’elles sont en solution dans l’eau.  
Les particules fluorescentes devaient également être hydrophiles et donc ne pas s’agglomérer lorsqu’elles sont en solution, qu’elles soient facilement mises en suspension. Le choix s’est donc porté auprès de nanoparticules fluorescentes qui émettent à une longueur d’onde excitable par un laser et que le détecteur (caméra CCD ou photomultiplicateur) interprète aisément.
La figure 4 montre qu’après tous les efforts menés, une concentration de Listéria à 100 CFU/mL est détectée. Cette concentration répond aux exigences en matière de sécurité alimentaire.

 

Figure 4 Concentration de Listéria


 

Unité de fluorescence d’un photomultiplicateur en fonction de la concentration de L. monocytogenes en solution.


Le prototype bêta (figure 5) est prévu pour être itinérant et pouvoir être testé en conditions réelles d’une usine agroalimentaire de préparation de produits bruts ou de transformation en un produit fini.

 

Figure 5: Prototype bêta de mesure rapide de la Listeria monocytogenes sur les surfaces.


Les équipements sont en cours de finalisation au premier semestre 2014. La suite du projet passe par la validation du protocole suivant la norme NF EN ISO 16140 et par la démonstration de l’intérêt de la technique auprès d’industriels du secteur agroalimentaire. Tous les volontaires peuvent se faire connaître auprès des auteurs.

 

Références bibliographiques

[1] Goulet V. et al. Bulletin épidémiologique, santé animale et alimentation n°50.

[2] Art 3.2 du Règlement CE n°2073/2005.

[3] Safefood Listeria Knowledge Network Annual Conference Nov 2013 Dublin.

[4] Site internet de ANSES recherche sur Listériose.

[5] Terrestrial manual OIE (Organisation Mondiale pour la Santé Animale) 2008 chapter 2.9.7.

[6] Norme ISO 11290-1 et -2 : Microbiologie des aliments - Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes - Partie 1 : méthode de recherche et Partie 2 : méthode de dénombrement.

[7] Yixian Wang, Zunzhong Ye and YibinYing  Sensors 2012, 12, 3449-3471.

[8] M.S. Gião, Episcopic differential interference contrast/epifluorescence microscopy to characterise Listeria. International symposium on problems of listeriosis (ISOPOL XVII), 2010.

[9]  M.S. Gião, A new device to collect Listeria monocytogenes from food industry surfaces (ISOPOL XVIII), 2013.

[10] M.S. Gião et C. Keevill, Journal of Applied Microbiology, 114, 256-265, 2012.

[11] N. Gilmartin, A rapid on-site immunosensor for the detection of L. monocytogenes. ASSET 2011. The Food Integrity and Traceability Conference.

 




Remerciements

Ces travaux sont issus des projets Biolisme  (n°232037 du 7e PCRD) et  Biolisme II (n°286713 du 7e PCRD) en partenariat avec les sociétés Beltelgeux (ES), Photek (UK) et les organismes de recherche Ainia (ES), l’université de Southampton (UK) et l’université de Dublin (IR). Les auteurs souhaitent vivement remercier Stéphane Hury, Fernando Lorenzo, Enrique Orihuel, Martin Ingle, Shobitha Sundararajan, José Belenguer, Sonia Porta, Salomé Giao, Bill Keevil et Niamh Gilmartin pour l’accomplissement de cet équipement prometteur.

 



Consulter l'intégralité du dossier " Mesurer la contamination de l’air et des surfaces "

Informations

Newsletter

2 fois par mois, recevez toute l'info de votre secteur : actualités, nouveaux services et produits, événements…

Je m'inscris

Actualités

Dossiers de la rédaction
  • 3 juin 2019
    Optimiser l’efficacité énergétique en salles propres est une tendance forte depuis quelques années. Pour ce faire, un des leviers est une maintenance appropriée des installations de traitement d’air. Domaine d’activité très normalisé, la maintenance est régie ...
  • 8 avril 2019
    Contre quoi luttons-nous en salle propre ? Différents types de polluants (chimiques, particulaires, microbiologiques) sont présents dans l’air extérieur comme intérieur, y compris en salle propre. Leur source et leur concentration diffèrent d’un environnement à ...
  • 5 février 2019
    400 000 m2 de surface de salles propres estimée en France, d’après une étude menée, en 2016, par l’Aspec, avec une première estimation de 11 TWh (revue par enquête Ceren à 6 TWh en 2018). Un constat qui fait réagir. Cette prise de conscience a conduit à une volonté ...
  • 1 février 2017
    La surveillance particulaire au sens de la nouvelle version de l’ISO 14644-2 conduit à une nouvelle approche, celle de la gestion du risque. Cette révisison a notamment pour but de  mieux connaître son installation et son process afin de déterminer les meilleurs ...
  • 25 janvier 2017
    Troisième secteur consommateur d'énergie en France, l'industrie utilise des salles propres et les environnements maîtrisés sont présents en établissements de santé. Une bonne gestion de la onsommation énergétique y est un enjeu important. Dans ce cadre, l'Aspec édite un guide ...

Produits et Services