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AGRO-ALIMENTAIRE

Validation des opérations de nettoyage et désinfection en IAA

PASCAL GARRY, Ifip | 1 septembre 2011 | Salles Propres n° 0075

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Dans le domaine agro-alimentaire, la validation de l'efficacité du nettoyage est rarement mise en place, les professionnels privilégiant plutôt un contrôle périodique de la qualité microbiologique des surfaces. Un objectif qui fait appel à des méthodes simples d'échantillonnage. Les cartes de contrôle permettent néanmoins d'assurer un suivi et de déterminer d'éventuelles dérives du système en place.

La réglementation européenne (règlement 178/2002 et l'ensemble des textes du paquet Hygiène) préconise entre autres la mise en oeuvre des bonnes pratiques hygiéniques. Les opérations de nettoyage et désinfection font partie de ces bonnes pratiques. À cette législation européenne s'ajoutent les normes (ISO 22000) et différents référentiels privés (British Retail Consortium ou BRC, International Food Standard ou IFS...).

Ainsi le nettoyage et la désinfection sont des prérequis (ISO 22000), nécessaires à la sécurité des denrées alimentaires : ce sont des activités de base indispensables pour maintenir un environnement hygiénique approprié à la production d'aliment sains pour la consommation humaine.

Si les professionnels de l'agro-alimentaire doivent s'assurer de l'efficacité de leurs procédures de nettoyage et désinfection, ceux-ci sont plus dans une démarche de vérification périodique (la période de contrôle dépend souvent du volume de production mais aussi de la sensibilité du produit au danger biologique) que de qualification ou validation de ces opérations de nettoyage et désinfection. Pour cela, ils utilisent dans la plupart des cas des méthodes permettant de vérifier la qualité microbiologique des surfaces, contrôlant donc ainsi l'efficacité globale du process (nettoyage et désinfection, que ces deux opérations soient réalisées simultanément ou l'une après l'autre). L'efficacité du nettoyage (ou détergence) est rarement vérifiée en IAA.

Pour vérifier l'efficacité de la désinfection il existe différentes techniques permettant de réaliser des contrôles microbiologiques des surfaces (lames de surface, boîtes de contact, écouvillons, chiffonnettes, Petrifilm, ATPmétrie). À côté de ces techniques il est possible de trouver quelques méthodes permettant de vérifier l'efficacité des opérations de nettoyage, méthodes reposant essentiellement sur la détection de protéines. Ces différentes techniques ont des efficacités variables et, compte tenu de leur principe, devraient avoir des applications différentes, ce qui n'est que très rarement le cas. En effet, elles sont indifféremment recommandées pour tout type d'activité ou de germes recherchés. L'objectif de cet article n'est pas de privilégier une méthode plus qu'une autre, mais bien de les recenser puis de montrer au travers des cartes de contrôle comment exploiter les résultats.

 

Le contrôle des opérations de détergence

Les opérations de nettoyage (ou détergence) visent à éliminer les souillures telles que les protéines d'origine animale ou végétale qui constituent des facteurs favorisant le développement bactérien (substrat nutritif pour les micro-organismes). Par ailleurs, la présence de protéines sur une surface peut réduire l'efficacité des désinfectants par piégeage des molécules actives. Par conséquent, avant toute opération de désinfection, il convient de réaliser un nettoyage (ou détergence) minutieux, c'est pourquoi il est possible de trouver sur le marché des tests « chimiques » permettant de valider ces opérations de nettoyage.

Ces tests chimiques détectent la présence de résidus protéiques microscopiques. Ils indiquent ainsi le niveau de propreté des surfaces ou matériels, mais ils ne détectent pas une contamination microbienne. Il ne s'agit en aucun cas d'un contrôle de l'efficacité des opérations de désinfection. Ces tests sont très faciles à utiliser. Ils reposent sur des réactions colorimétriques comme l'utilisation du colorant de Biuret.

D'un point de vue pratique, deux méthodologies existent :

- le prélèvement est effectué avec un écouvillon (ou une bandelette) qui est ensuite transféré dans un tube contenant le réactif colorimétrique ;

- le prélèvement est effectué avec une bandelette préimbibée avec le réactif colorimétrique.

Dans les deux cas la lecture se fait par rapport à une échelle de référence.

En fonction du kit, le seuil de sensibilité de la méthode est de 10 à 50 µg de protéine « décrochée » de la surface. Le résultat est obtenu en quelques minutes (une dizaine maximum).

Les résultats obtenus rapidement permettent d'entreprendre aussitôt les actions correctrices nécessaires en cas de défaut de nettoyage. Cependant, se contenter de ce type de test peut faire oublier l'objectif premier des opérations de nettoyage et désinfection en IAA qui est de diminuer le risque de contamination microbiologique des denrées par les surfaces. On ne peut pas assimiler la propreté « organique » à la propreté « microbiologique ».

Parfois un simple contrôle visuel, bien souvent oublié dans l'entreprise, peut être suffisant pour qualifier une opération de nettoyage.

 

Le contrôle des opérations de désinfection

On peut distinguer deux grandes familles de méthodes de prélèvements pour l'échantillonnage et le contrôle microbiologique des surfaces : par contact ou empreinte, et par frottis.

 

Méthodes par empreinte

Les méthodes par empreinte regroupent l'ensemble des méthodes consistant à appliquer une gélose sur la surface à échantillonner. On réalise en quelque sorte une empreinte de la contamination. Ces techniques sont parmi les plus utilisées. Elles présentent l'avantage d'être disponibles sans préparation et de ne requérir qu'une incubation après le prélèvement. Parmi les méthodes utilisables, citons les boîtes de contact (dites aussi boîtes de Rozier-Pantaléon ou boîtes Rodac), les lames gélosées et les Petrifilm (3M). Leur utilisation ne nécessite pas obligatoirement la présence d'un laboratoire sur le site de production (simple incubation, puis lecture). Pour chacune de ces méthodes, il convient d'utiliser un milieu de culture contenant un ou plusieurs neutralisants de nettoyage et désinfection, des résidus pouvant subsister sur les surfaces contrôlées.

 

Les boîtes de contact ou boîtes Rodac

Les boîtes Rodac sont des boîtes circulaires de type boîte de Petri, d'un diamètre de 5,5 cm, contenant un milieu gélosé (milieu nutritif permettant le développement bactérien) légèrement bombé que l'on pose directement sur la surface à contrôler. La boîte est ensuite incubée à la température optimale du germe recherché entre 24 et 48 heures selon le micro-organisme. Après incubation, les colonies caractéristiques du germe sont dénombrées et le résultat est exprimé en germes par centimètre carré. La surface contrôlée avec cette technique est de 23,75 cm2.

L'utilisation de boîtes Rodac présente plusieurs avantages : elles nécessitent peu de manipulations, les prélèvements sont rapides et simples à effectuer. Cependant, la gélose étant dans un support rigide, les contrôles ne sont possibles que sur des surfaces planes et pleines. Par ailleurs les surfaces doivent être sèches pour éviter un développement des bactéries en nappe qui rendrait la lecture impossible.

 

Les lames de contact ou lames de surface

Les lames de contact, également appelées lames de surfaces, sont constituées d'une lame de plastique rectangulaire d'environ 10 cm2 recouverte d'une gélose nutritive. Le principe est identique à celui des boîtes Rodac, la gélose nutritive est appliquée sur la surface à contrôler. La plupart des lames de surfaces sont bifaces, avec un milieu de culture différent sur chacune des deux faces. Les avantages et inconvénients de ces lames sont identiques à ceux des boîtes Rodac.

Pour faciliter le prélèvement, il est préférable d'utiliser des lames dites « articulées » : ces lames se plient au niveau du bouchon ce qui permet un meilleur contact entre la gélose et la surface.

Pour faciliter le prélèvement sur des surfaces courbes, la société Biotest a mis au point des lames de contact (lames Hycon) dont la gélose est segmentée en plus petites surfaces, ce qui rend la lame flexible. Elles existent avec différents milieux de culture (flore totale, coliformes...) mais, contrairement aux lames classiques, il n'y a qu'un seul milieu de culture par lame. Par ailleurs, il est à noter que la surface échantillonnée avec ces lames est de 25 cm2, ce qui permet d'obtenir un prélèvement un peu plus représentatif de la contamination. Comme pour les lames classiques les surfaces doivent être sèches.

 

Le Petrifilm

Cette méthode de prélèvement est commercialisée par la société 3M. Un Petrifilm est constitué de deux films sur l'un desquels se trouve un substrat nutritif, un gélifiant soluble dans l'eau froide et un indicateur coloré qui permet de faciliter le dénombrement des colonies.

La surface échantillonnée est de 20 cm2 à l'exception des Petrifilm levures/moisissures et staphylocoques qui permettent d'échantillonner 30 cm2. D'un point de vue pratique il doit être réhydraté avec 1 mL de diluant (eau distillée, eau distillée avec neutralisant). La surface gélosée est ensuite appliquée sur la zone à échantillonner, puis le système est incubé à la température requise pour le germe recherché. Les colonies sont ensuite dénombrées. La faible épaisseur du Petrifilm lui confère une grande souplesse, ce qui permet d'échantillonner des surfaces de formes différentes comme les arrondis, angles ou encore poignées de porte.

Méthodes par frottis

Le principe des méthodes dites par frottis repose sur le décrochement des micro-organismes par frottement de la surface avec un support qui va récupérer les bactéries détachées de la surface échantillonnée. Le dénombrement des germes après remise en suspension dans un diluant peut s'effectuer par différentes techniques comme la microbiologie classique, l'ATPmétrie ou encore la cytométrie de flux. Certaines de ces méthodes permettent d'échantillonner de grandes surfaces.

Les avantages de ces méthodes sont les suivantes :

- réalisation de prélèvements sur des supports de dimensions variées (jusqu'à plusieurs mètres carrés avec les chiffonnettes) ;

- réalisation de prélèvement sur des supports à géométrie variée ;

- recherche et dénombrement de nombreux germes différents à partir d'un seul et même prélèvement.

 

Écouvillons

Les écouvillons ressemblent à des cotons-tiges. D'un point de vue pratique il suffit de frotter l'écouvillon stérile sur la surface à échantillonner. Afin de garantir un prélèvement sur une surface identique d'un contrôle à un autre ou d'un point de prélèvement à un autre, il convient d'utiliser un gabarit stérile d'une surface donnée (25 ou 100 cm2 par exemple). Après le prélèvement, l'écouvillon est placé dans du diluant. Puis le prélèvement est traité comme un échantillon classique (dilutions décimales et ensemencement de milieux spécifiques). Afin d'éviter l'inhibition de la croissance des germes par les résidus de désinfectant, le diluant doit contenir des neutralisants.

Le prélèvement par écouvillonnage présente différents avantages par rapport aux méthodes par empreinte. Il permet ainsi de contrôler des zones difficiles à échantillonner par les techniques d'empreinte, comme les petites pièces de matériel, les canalisations, les fils de convoyeur, les poignées de porte ou encore les évaporateurs. Si le niveau de contamination d'une surface est important il est possible d'obtenir un résultat de dénombrement en effectuant des dilutions décimales du diluant dans lequel les bactéries ont été remises en suspension.

Si l'écouvillon permet d'échantillonner des surfaces « difficiles d'accès », le prélèvement sur des surfaces importantes devient vite fastidieux, il faut alors avoir recours au chiffonnage.

 

Éponges ou chiffonnettes

L'utilisation d'éponges ou de chiffonnettes pour effectuer des contrôles de la qualité microbiologique permet d'échantillonner de grandes surfaces pouvant aller jusqu'à plusieurs mètres carrés. Cette technique est particulièrement intéressante dans le cas de la recherche de germes dont la contamination est très hétérogène. C'est particulièrement le cas pour Listeria ou Salmonella qui, lorsqu'elles sont présentes dans un atelier, le sont au sein de niches (évaporateurs, siphons...). Comme pour les écouvillons, les chiffonnettes ou les éponges doivent être préimbibées d'un diluant contenant des neutralisants afin d'annuler les effets d'éventuels résidus de désinfectant. Lorsque le prélèvement est effectué, la chiffonnette est transférée dans un sachet stérile puis traitée comme un échantillon classique de microbiologie.

 

ATPmétrie

L'ATP (adénosine triphosphate), source d'énergie, est présente dans toute cellule vivante. En mesurant l'ATP intracellulaire il est possible d'estimer la quantité de micro-organismes présents dans l'échantillon (estimation semi-quantitative).

Pour cela l'ATP intracellulaire est dosée, après lyse des cellules microbiennes, avec le système luciférine/luciférase (figure 1). La réaction de dégradation de l'ATP en AMP avec ce système produit des photons, donc de la lumière, dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'ATP présente dans l'échantillon. Celle-ci peut être mesurée à l'aide d'un luminomètre.

Le résultat obtenu ne peut pas être corrélé à une quantité de micro-organismes par centimètre carré ou unité prélevée. En effet la quantité d'ATP intracellulaire varie d'un micro-organisme à un autre et en fonction de son état physiologique. Bien souvent les systèmes proposés (simples d'utilisation) se contentent de donner une information qualitative (de type diode verte « c'est bon », diode orange « attention » et diode rouge « c'est mauvais »).

Si le contrôle par ATPmétrie permet d'obtenir une réponse rapide sur l'efficacité d'une opération de nettoyage et désinfection, il ne permet pas de mettre en évidence une dérive de celle-ci, telle qu'une augmentation faible mais constante de la quantité de bactéries présentes sur les surfaces. Cependant en cas de véritable défaut de nettoyage et désinfection, l'ATPmétrie permettra de mettre en place une action corrective immédiate, ce qui n'est pas possible avec les techniques fondées sur la microbiologie classique.

 

La cytométrie de flux

La cytométrie de flux est une technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser. La lumière réémise lors du passage d'une particule (par diffusion ou fluorescence) permet de visualiser et donc de dénombrer ces particules.

En utilisant des marqueurs fluorescents spécifiques d'une espèce bactérienne ou d'un groupe bactérien, il est alors possible de dénombrer les cellules correspondantes. Il est par ailleurs possible d'utiliser des marqueurs dits de viabilité qui ne marquent que les cellules vivantes. La technique de cytométrie de flux permet de dénombrer les cellules décrochées des surfaces par écouvillonnage par exemple.

 

Cartes de contrôle

L'objectif du contrôle des procédures de nettoyage et désinfection n'est pas uniquement de valider la qualité d'une opération unitaire mais bien de vérifier que cette opération, faisant partie du procédé, est maîtrisée au cours du temps. Dans ce cas, les résultats, bien souvent variables, ne sont pas exploités individuellement mais globalement. Pour cela on considère que l'efficacité des opérations de nettoyage et désinfection, lorsqu'elles sont maîtrisées, est stable au cours du temps. À cette efficacité est associée une variabilité « standard », elle-même stable.

À travers l'utilisation de cartes de contrôle, on cherche à détecter la perte de maîtrise des opérations de nettoyage et de désinfection qui se manifeste alors par l'obtention de valeurs de contamination allant au-delà de cette variabilité standard. Les cartes de contrôle permettent donc de suivre l'évolution de la qualité microbiologique d'un procédé (exemple le nettoyage et la désinfection). Ces cartes se présentent traditionnellement sous forme de graphiques sur lesquels sont reportés chronologiquement les paramètres surveillés (contamination microbienne par centimètre carré par exemple) lors de chaque contrôle. D'un point de vue pratique il est possible de reporter un résultat individuel ou une moyenne de plusieurs dénombrements (cartes aux mesures) ou bien encore un nombre d'analyses considérées comme non conformes, comme le nombre de prélèvements avec « présence de Listeria » (cartes aux attributs).

Lors de la mise en place d'une carte de contrôle il faut définir le niveau cible du paramètre surveillé (par exemple en cellules/cm2) ainsi que des limites de contrôle qui permettent de mettre en évidence une perte de maîtrise du procédé lorsque le paramètre se retrouve au-delà (figure 2).

Il existe deux grands types de cartes de contrôle :

- les cartes non cumulatives qui permettent de prendre une décision sur la maîtrise du procédé à partir des résultats obtenus lors de chaque contrôle. Ces cartes ne mettent en évidence que des dysfonctionnement importants ;

- les cartes de contrôle cumulatives pour lesquelles les résultats obtenus lors de plusieurs contrôles successifs sont cumulés afin de prendre la décision fondée sur la maîtrise du procédé (par exemple de nettoyage et désinfection). L'avantage de ce type de carte c'est de pouvoir détecter des dysfonctionnements faibles.

 

Les cartes de contrôle les plus couramment utilisées sont des cartes cumulatives dont la période de cumul des résultats est limitée (les n derniers résultats). Il s'agit de cartes de contrôle cumulatives à fenêtre mobile. C'est ce type de carte qui doit être privilégié dans le cadre du contrôle des procédures de nettoyage et désinfection.

Une carte de contrôle doit pouvoir détecter rapidement une perte de maîtrise du procédé contrôlé. Plus les limites de contrôle sont proches du niveau cible, plus la détection d'une dérive est précoce. En revanche ce rapprochement des limites de contrôle s'accompagne également d'une augmentation du risque de fausse alarme : les limites sont dépassées alors que le procédé est parfaitement maîtrisé.

Il est donc nécessaire de trouver un équilibre entre la nécessité de détecter rapidement des pertes de maîtrise et la nécessité de ne pas mettre en oeuvre trop souvent des actions correctives non justifiées.

 

Conclusion

La validation et/ou la vérification des opérations de nettoyage et désinfection en industrie agro-alimentaire sont des notions difficiles à appréhender pour les professionnels tant sur l'échantillonnage que sur l'interprétation des résultats. Le choix des critères à appliquer dépendra avant tout de la méthode utilisée, mais également du site de prélèvement et de la sensibilité du produit alimentaire vis-à-vis du danger considéré. Il est difficile d'établir des valeurs limites applicables à l'ensemble des entreprises. Celles-ci doivent établir leurs propres limites à partir de l'historique des prélèvements effectués sur une période de référence (une année par exemple), la valeur limite peut être fixée par exemple au 99e ou 95e centile.

L'interprétation et le déclenchement d'actions correctives peut s'effectuer par site de prélèvement ou pour un ensemble de sites.

Lorsqu'un professionnel a choisi une méthode de prélèvement il doit s'y tenir, sans quoi la comparaison d'une période de prélèvement à une autre ne pourrait pas être effectuée et les limites définies au préalable ne seraient plus applicables.

Par ailleurs, l'utilisation de cartes de contrôle est vivement recommandée pour suivre l'efficacité des opérations de nettoyage et désinfection au cours du temps et détecter rapidement une dérive du système.

Consulter l'intégralité du dossier " La validation des process aseptiques "

Consulter l'intégralité du dossier " Validation et contrôle du nettoyage en ultrapropreté "

Plus de Photos

Le contrôle repose sur des tests très simples, comme la réaction de Biuret.

Les boîtes Rodac sont pratiques d'utilisation, mais ne permettent de prélèvement que sur des surfaces planes et pleines.

La faible épaisseur du Petrifilm permet d'échantillonner des surfaces de formes différentes comme les arrondis, angles ou encore poignées de porte.

1 Principe de l'ATPmétrie Si l'ATP est présente dans toutes les cellules vivantes, elle ne permet toutefois pas de compter les bactéries, a fortiori de les discriminer.

2 Exemple de carte de contrôle avec niveau cible et limite de contrôle (Afssa, 2008) L'utilisation de cartes de contrôle permet de détecter la perte de maîtrise des opérations de nettoyage et de désinfection, à travers l'obtention de valeurs de contamination allant au-delà de cette variabilité standard.

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