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INNOVATION

Détection simultanée de la taille et de la nature des contaminants

Par JEAN-SÉBASTIEN BONIN, PMT | 1 novembre 2011 | Salles Propres n° 0076

PMT France
Boosté par la nécessité de détecter rapidement les contaminants microbiologiques, le développement de méthodes de microbiologie rapide a généré une multitude de technologies. L'une d'entre elles permet de déterminer simultanément et en temps réel la taille et le caractère biologique ou inerte des particules, aboutissant à un outil analytique particulièrement pertinent lors de MFT, d'analyses de risque ou d'investigation sur des sources potentielles de contamination ou du contrôle microbiologique en continu.

Cette technologie a été développée entre 2001 et 2002, notamment suite aux événements de septembre 2001. Le contexte faisait alors craindre une attaque biologique terroriste sur la base de spores modifiées de Bacillus anthracis. De gros budgets de recherche ont ainsi été mobilisés par l'armée américaine pour la conception et l'évaluation de technologies permettant une détection immédiate de quantités relativement importantes de micro-organismes sur de l'air extérieur.

Parmi tous les prototypes passés au crible, la détection de micro-organismes fondée sur la spectroscopie optique s'est démarquée. Depuis la fin des années quatre-vingt-dix cette technologie était utilisée pour la détection d'allergènes dans l'air, puis a été adaptée pour l'armée américaine. Depuis 2005, la sensibilité et la spécificité ont été considérablement améliorées pour répondre aux besoins de l'industrie pharmaceutique et des environnements ultrapropres.

 

Les VBNC

Les organismes viables mais non cultivables (VBNC) constituant une menace permanente, la question est simple : comment maîtriser complètement un risque s'il ne peut être détecté et quantifié ? Les VBNC et la possibilité de libérer les lots avant les résultats de tests classiques reposant sur la croissance des micro-organismes ont été le moteur du développement de quantité de méthodes de microbiologie dites rapides (RMM) dont un classement non exhaustif est présenté sur la figure 1.

Les VBNC continuent de faire couler beaucoup d'encre : plus de 400 articles ont été publiés sur le sujet depuis 1982. Il existe quantité de raisons relativement bien identifiées à ce jour et expliquant l'absence de croissance d'un germe, ou dormance. Stress thermique, chimique, absence d'eau, passage d'un milieu hostile et carencé à un milieu nutritif riche, facteurs de croissance manquants, teneur en CO2 ou O2... Un rapport publié en 1997 par Heidelberg et al. indique que beaucoup de bactéries restent viables après avoir été aéroportées, mais perdent leur faculté de former des colonies.

De nombreux micro-organismes possèdent un état de dormance avéré, ils sont répertoriés dans le tableau A.


[Tableau A] Micro-organismes possédant un état de dormance

Aeromonas salmonicida Agrobacterium tumefaciens Alcaligenes eutrophus
Aquaspirillum sp. Burkholderia cepacia Burkholderia psudomallei
Camphylobacter coli Camphylobacter jejuni Camphylobacter lari
Cytophaga allerginae Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis Enterococcus hirae Enterococcus faecium
Escherichia coli Francisella tularensis Helicobacter pylori
Klebsiella aerogenes Klebsiella pneumoniae Klebsiella planticola
Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis Legionella pneumophilia
Listeria monocytogenes Micrococcus flavus Micrococcus luteus
Micrococcus varians Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium smegmatis
Pasteurella piscida Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas putida Pseudomonas syringae Ralstonia solanacearum
Rhizobium leguminosarum Rhizobium meliloti Rhodococcus rhodochrous
Salmonella enteridis Salmonella typhi Salmonella typhirium
Serratia marcescens Shigella dysenteriae Sinorhizorium meliloti
Streptococcus faecalis Tenacibaculum sp. Vibrio anguillarum
Vibrio campbellii Vibrio cholerae Vibrio fischeri
Vibrio harveyi Vibrio mimicus Vibrio natriegens
Vibrio parahaemolyticus Vibrio proteolytica Vibrio shiloi
Vibrio vulnificus types 1 et 2 Xanthomonas campestris  
La dormance est un état dans lequel le micro-organisme vit, sans pour autant exprimer d'activité de croissance.


Le milieu de culture TSA communément utilisé ne convient que pour la croissance d'une fraction de micro-organismes (tableau B).

 

 [Tableau B] Flore typique des voies aériennes supérieures humaines.

Bactéries Nez Pharynx bouche
Staphylococcus epidermidis ++ ++ ++
Staphylococcus aureus* + + +
Streptococcus mitis + ++
Streptococcus salivarius ++ ++
Streptococcus mutans* + ++
Streptococcus pneumoniae* +/- + +
Streptococcus pyogenes + +
Neisseria sp. + ++ +
Neisseria meningitidis + ++ +
Proteus sp. + + +
Haemophilus influenzae* + + +
Lactobacillus sp. + ++
Corynebacteria ++ + +
Actinomycetes + +
Spirochetes ++ ++
Mycoplasmas + +

Turquoise : pousse sur milieu TSA/TSB. Rouge : non cultivable (en conditions classiques d'incubation) sur TSA/TSB.

Orange : peut pousser sur TSA/TSB.
Source : Regulatory Expectations for Aseptically Produced Parenterals, Ian
Symonds, directeur de l'assurance qualité aseptique, GlaxoSmithKline, déc. 2009, PDA Meeting, Milan.

 

Enfin les aérobiocollecteurs possèdent une efficacité biologique et une efficacité physique d'impaction très variables d'un modèle à un autre selon la vitesse d'impaction, la conception des cribles ou l'utilisation de milieu complémentés.

L'ensemble des éléments cités plus haut rappelle simplement à la vigilance et à l'ouverture sur de nouvelles technologies plus sensibles, ceci même si les techniques classiques ont été éprouvées et ont fait leurs preuves depuis des années.

La position de la FDA est claire sur ce sujet : la division spécialisée dans l'évaluation des RMM voit d'un oeil favorable l'adoption de nouvelles technologies plus sensibles et résolutives permettant une meilleure connaissance et donc un meilleur contrôle des process.

Pour ces RMM, les seuils de conformité définis dans l'annexe 1 des BPF peuvent même être revus à la hausse puisque adaptés aux méthodes classiques moins sensibles, à condition bien entendu que cela repose sur un solide dossier de validation.

 

Fonctionnement

Le système Biovigilant utilise une propriété naturelle de certains métabolites présents dans les micro-organismes : l'émission d'un rayonnement de fluorescence en réponse à l'excitation induite par de la lumière laser. Le NADH (nicotinamide adénine dinucléotide oxydé) et la riboflavine sont deux coenzymes utilisés pour les formes végétatives et l'acide dipicolinique (constituant de la paroi) pour les formes sporulées.

Deux informations seront données, la taille de la particule obtenue en diffraction de la lumière laser et, au même instant et en fonction de la détection ou non de la fluorescence, s'il s'agit d'une particule inerte ou biologique (figure 2).

La fluorescence est captée par un réflecteur semi-ellipsoïdal dont la fonction est de recueillir, d'amplifier considérablement et de focaliser le signal sur le tube photomultiplicateur.

La chambre optique a été mathématiquement modélisée (figure 3), la forme particulière du réflecteur va collecter la fluorescence émise par le micro-organisme selon un angle de 270 degrés, amplifiant par un facteur 100 à 1 000 le signal par rapport à des systèmes optiques classiques, qui détectent la fluorescence sur quelques degrés, voire moins. Ce dispositif rend possible la visualisation en temps réel sans marquage préalable.

Le coeur du système est conçu avec un niveau de bruit remarquablement bas, la fluorescence induite par une bactérie monodispersée étant très faible. De nombreux seuils, en fluorescence, en diffraction laser et sur des ratios de ces deux grandeurs ont été définis puis validés pour garantir la spécificité du système aux micro-organismes, bactéries, levures et moisissures.

Biovigilant a également développé une particule submicronique présentant une réponse en fluorescence comparable à celle d'une bactérie monodispersée. Cette dernière est utilisée pour vérifier le seuil de détection.

Le système va plutôt détecter les organismes viables, même si aucune garantie sur ce point n'est revendiquée par le concepteur. Dans le cas de destruction par des agents chimiques oxydants, les métabolites sont dénaturés et ne fluorescent plus. Dans le cas de destruction par la chaleur sèche ou chaleur humide le signal passe en dessous du seuil de détection après une durée très variable d'un micro-organisme à un autre, de quelques heures à quelques jours.

Le système ne permet pas la récupération des germes pour une analyse ultérieure.

 

Validation selon USP 1223/EP 5.1.6

L'IMD-A de Biovigilant a été validé dans le laboratoire G-lab du groupe Yamatake à Fujisawa au Japon, niveau de sécurité P2. Le matériel utilisé est présenté dans le tableau C.

 

 [Tableau C] Matériel utilisé pour la validation de l'IMD-A selon USP 1223/EP 5.1.6

Bactéries 12 répétitions de 5 espèces à 5 dilutions
Bacilles Gram + sporulés Bacillus atrophaeus
Gram + végétatifs Corynebacterium afermentans
Micrococcus lylae
Staphylococcus epidermidis
Gram - végétatifs Escherichia coli
Équipements Enceinte G-Lab pour la recherche sur les aérosols
Nébuliseur des laboratoires Salter
Compteur de particules Kanomax 9600
Équipements comparés IMD-A 300 system 1.15 LPM
IMD-A 350 system 28,3 LPM
SAS Super 100
MAS 100NT
SMA instrument
La validation s'est effectuée dans le laboratoire G-lab du groupe Yamatake (Fujisawa, Japon), niveau de sécurité P2.

 

L'enceinte de test (figures 4 et 5) a un volume de 2,9 m3 en ISO 4, 200 renouvellements par heure avec un environnement extérieur en classe B.

Elle comprend sur sa face inférieure cinq ports de prélèvement pour des compteurs de particules ou les systèmes IMD-A et sur sa face arrière quatre vannes automatiques pour l'échantillonnage des biocollecteurs. Afin d'assurer l'homogénéité de l'aérosol généré au centre de la chambre, six ventilateurs sont disposés, quatre à chaque angles inférieurs et deux au centre.

Les parois sont en polycarbonate antistatique pour limiter la rétention de particules sur les surfaces.

La qualité de l'homogénéisation a été testée avec des billes de 0,8 mm, selon la JIS 3836 annexe 2 « Standard for evaluation of chamber uniformity » (figure 6).

L'ensemble des comptages observés sur chacun des sept ports de prélèvement ne doivent pas s'écarter de plus de 10 % de la moyenne.

 

Précision

L'IMD-A doit avoir des résultats équivalents ou meilleurs que ceux obtenues avec les méthodes classiques. Selon l'USP et l'EP au moins cinq suspensions couvrant la gamme de mesure doivent être analysées pour chaque micro-organisme. Douze répétitions on été préparées pour chaque dilution afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs.

La précision a été évaluée avec les critères d'acceptation suivant :

- la moyenne de l'IMD-A pour chaque dilution et chaque micro-organisme est supérieure ou égale à 70 % de la moyenne pour chaque dilution et chaque micro-organisme obtenue avec les biocollecteurs de référence ;

- si le premier critère n'est pas atteint, une évaluation statistique de l'écart est effectuée avec un test t à 95 % d'intervalle de confiance.

 

Autres paramètres

L'exactitude avec le calcul pour chaque série de mesures de la RSD (relative standard deviation), la spécificité, la limite de détection, la limite de quantification ont été testées. Pour le critère d'acceptation, l'IMD-A doit présenter des résultats similaires ou supérieurs aux biocollecteurs.

 

Linéarité

Pour la linéarité, le coefficient de détermination R2 a été calculé pour chaque série de mesures (nuage de points constitués par les douze répétitions aux cinq dilutions), ceci pour les cinq germes, les trois biocollecteurs, l'IMD-A et le compteur de particules fixé ici comme référence.

Le R2 est utilisé pour caractériser la qualité de corrélation d'un instrument par rapport à un autre. Une valeur proche de 0 indique qu'il n'y a pas de corrélation, une valeur proche de 1 indique un très bon niveau de corrélation.

Une régression linéaire simple utilisant la méthode des moindres carrés a été effectuée, utilisant le compteur de particules comme variable indépendante et chacun des équipements IMD-A et biocollecteurs comme variable dépendante.

De faibles valeurs de R2 ont été observées pour l'ensemble des équipements IMD-A et des biocollecteurs pour M. lylae. La souche utilisée s'est révélée sensible au procédé de nébulisation avec un comportement très hétérogène tant au niveau de la fluorescence que de la viabilité/croissance, ceci affectant le R2 et les résultats de la linéarité.

La linéarité a été évaluée avec comme critère d'acceptation : « le R2 de l'IMD-A est supérieur ou égal aux R2 des biocollecteurs ».

 

Spécificité 2

Ce test challenge l'IMD-A sur la possibilité de détection de faux positifs. Cinq matériaux communément rencontrés dans les environnements propres et pouvant produire une réponse en fluorescence à la longueur d'onde de 405 nm ont été testés.

Une différence statistiquement significative, sur le bruit de fond, en présence et en absence des matériaux a tenté d'être établie en utilisant un test t avec un niveau de confiance à 95 %.

L'ensemble des résultats sont présentés dans un tableau de synthèse (tableau D).

 

 [Tableau D] Tableau récapitulatif des résultats de validation selon USP 1223/EP 5.1.6

Légende: Conforme aux critères IMD-A 350 Matrice de test delon USPTests effectués au laboratoire Yamatake G-lab
IMD-A 350 Comparaison de 3 Biocollecteurs d'air sur 5 concentrations
Non-conforme sur l'un des
deux systèmes IMD-A testé
Non-conforme sur des
deux systèmes IMD-A testés
SAS Super 100 (100LPM) MAS 100NT (100LPM) SMA
Test Micro-organisme T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5
Précision (IMD-A %) Bacillus atrophaeus                              
Escherichia coli                              
Staphylococcus epidermidis                              
Micrococcus lylae                              
Corynebacterium afermentans                 62 %            
Exactitude (%RSD) Bacillus atrophaeus                              
Escherichia coli                         17%
18%
11%
   
Staphylococcus epidermidis           22 %
21 %
                 
Micrococcus lylae                              
Corynebacterium afermentans                              
Spécificité 1 Bacillus atrophaeus                              
Escherichia coli                              
Staphylococcus epidermidis                              
Micrococcus lylae                              
Corynebacterium afermentans                              
Limite de Détection Bacillus atrophaeus   Effectué uniquement sur la
plus faible concentration
  Effectué uniquement sur la
plus faible concentration
  Effectué uniquement sur la
plus faible concentration
Escherichia coli      
Staphylococcus epidermidis      
Micrococcus lylae      
Corynebacterium afermentans      
Limite de Quantification Bacillus atrophaeus   Effectué uniquement sur la
plus faible concentration
  Effectué uniquement sur la
plus faible concentration
  Effectué uniquement sur la
plus faible concentration
Escherichia coli      
Staphylococcus epidermidis      
Micrococcus lylae      
Corynebacterium afermentans      
Linearité Bacillus atrophaeus R²IMD-A 350 = 1,00 R²IMD-A 350 = 1,00 R²IMD-A 350 = 1,00 R²IMD-A 350 = 1,00 R²IMD-A 350 = 1,00 R²IMD-A 350 = 1,00
Escherichia coli R²IMD-A 350 = 0,95 R²IMD-A 350 = 0,96 R²IMD-A 350 = 0,95 R²IMD-A 350 = 0,96 R²IMD-A 350= 0,95 R²IMD-A 350 = 0,96
Staphylococcus epidermidis R²IMD-A 350 = 0,99 R²IMD-A 350 = 0,99 R²IMD-A 350 = 0,99 R²IMD-A 350 = 0,99 R²IMD-A 350 = 0,99 R²IMD-A 350 = 0,99
Micrococcus lylae R²IMD-A 350= 0,48 R²IMD-A 350 = 0,64 R²IMD-A 350 = 0,48 R²IMD-A 350 = 0,64 R²IMD-A 350 = 0,48 R²IMD-A 350 = 0,64
Corynebacterium afermentans R²IMD-A 350= 0,94 R²IMD-A 350 = 0,93 R²IMD-A 350= 0,92 R²IMD-A 350 = 0,90 R²IMD-A 350 = 0,94 R²IMD-A 350 = 0,93
Plage de mesure Bacillus atrophaeus                              
Escherichia coli                              
Staphylococcus epidermidis                              
Micrococcus lylae                              
Corynebacterium afermentans                              
 
Légende: Conforme aux critères Matrice de tests selon USPet tests environnementaux réalisés directement par Biovigilant
IMD-A 350
Non conforme aux critères
Test Tested Material
Specificité 2 70% IPA, WFI  
Tryptic Soy Broth  
Papier Salle Propre  
Cleanroom Tyvek  
Spray Silicone Analyse impossible le silicone adhérant aux optiques
Riboflavine  
  Operating temperature range of 15-30°C, and operating humidity range of 10-80% RH non-condensing
Test Vibration vibrations horizontales et verticales testées avec succès de 5 Hz à 300 Hz et de 0,25g à 1,00g
Fonctionnement en Altitude Testé avec succès à une pression équivalente à une altitude de 2 145 m
Une valeur unique mentionnée pour la précision indique qu'un instrument sur les deux n'a pas respecté les critères d'acceptation, deux valeurs indiquent que les deux instruments ont échoués. Deux valeurs mentionnées pour l'exactitude indiquent qu'un instrument sur les deux n'a pas respecté les critères d'acceptation, trois valeurs indiquent que les deux instruments ont échoué. Dans les deux cas la valeur affichée représente la RSD en pourcentage du biocollecteur comparé.


Implémentation

Au regard des autorités américaines et européennes, l'IMD-A est un outil additionnel de contrôle process en ligne, très intéressant pour la récolte d'informations et la maîtrise de l'environnement et ne nécessitant pas de soumission ou d'approbation particulière de la part des autorités pour son implémentation. Celle-ci se déroule selon cinq étapes présentées ci-dessous :

Étape 1 : préparation de la validation

- écrire une description de la technique et de l'application prévue ;

- effectuer une analyse bénéfice/risque ;

- travailler en interne avec des biostatisticiens pour développer le plan de validation (nombre de prélèvements, critères de conformités etc.) ;

- consulter une personne qualifiée pour la revue du projet ;

- effectuer des tests de faisabilité ou préfaisabilité.

Étape 2

Contacter l'organisme en charge de l'inspection BPF et l'informer du projet d'implémentation et d'évaluation de l'IMD-A.

Étape 3

Effectuer les DQ, IQ, OQ, PQ.

Étape 4

Écrire un rapport qualité et implémenter l'IMD-A en utilisant le change control interne.

Étape 5

Contacter l'inspecteur BPF pour une revue de l'ensemble des résultats de validation.

 

Conclusion

L'IMD-A est un puissant outil analytique dont l'utilisation est particulièrement pertinente lors de media fill tests, d'analyses de risque ou encore lors d'investigations sur des sources potentielles de microcontaminations.

Le système apporte une solution en temps réel et indépendante des contraintes complexes de biocollection et de croissances rencontrées sur les méthodes classiques.

Cette technologie permet également un véritable contrôle en continu du niveau de contamination microbiologique et de fait s'intègre parfaitement dans des démarches de Quality by Design.

Consulter l'intégralité du dossier " Contamination microbiologique échantillonnage et identification "

Consulter l'intégralité du dossier " Monitoring et contrôles périodiques en salles propres "

Plus de Photos

[Fig.1] Taxonomie des RMM. La nécessité d'obtenir des résultats rapides a impulsé le développement de très nombreuses techniques de microbiologie.

[Fig.2] Schéma fonctionnel de la chambre optique système Biovigilant. Le dispositif permet d'accéder simultanément à deux informations : la taille de la particule et son caractère inerte ou biologique.

[Fig.3] Modélisation mathématique de la chambre optique. La forme particulière du réflecteur collecte la fluorescence émise par le micro-organisme selon un angle de 270°, amplifiant le signal par un facteur 100 à 1 000.

[Fig.4] Présentation de la chambre G-lab pour l'étude sur les aérosols 1/2. L'enceinte de test affiche un volume de 2,9 m3 (ISO 4) et un renouvellement de 200 vol/h avec un environnement extérieur en classe B.

[Fig.5] Présentation de la chambre G-lab pour l'étude sur les aérosols 2/2. Six ventilateurs assurent l'homogénéité de l'aérosol généré au centre de la chambre.

[Fig.6] Test de l'homogénéité de l'aérosol généré selon JIS 3836 . La qualité de l'homogénéisation a été testée avec des billes de 0,8 µm.

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